PCR是一種(zhǒng)新(xīn)的核酸(suān)定(dìng)量技(jì)術，該技術是(shì)在常規PCR的基(jī)礎上，加入(rù)熒光標記的(dí)探針或相應的(dí)熒光染料(liào)來實(shí)現(xiàn)其定量功能。其原(yuán)理是(shì)隨(suí)著(zhuó)PCR反應(yīng)的進行(háng)，PCR反應產物(wù)不斷積(jī)累(léi)，熒光信號強(qiáng)度成(chéng)比例(lì)增(zēng)加；每次循環後采(cǎi)集(jí)熒光強度(dù)信號(hào)，通過(guò)熒光強(qiáng)度(dù)的變化監(jiān)測產(chǎn)物量的(dí)變(biàn)化，從而得(dé)到熒(yíng)光擴增曲綫。
隨著(zhuó)臨床醫(yī)學(xué)和(hé)生物(wù)診(zhěn)斷(duàn)試(shì)劑的發展，為滿(mǎn)足臨床(chuáng)需(xū)要(yào)，需(xū)要(yào)開(kāi)發(fā)一(yī)種不需要(yào)低(dī)溫(wēn)儲存(cún)和(hé)運(yùn)輸的(dí)熒光PCR擴增(zēng)試劑(jì)。由於(yú)熒(yíng)光PCR反(fǎn)應體(tǐ)係中含有(yǒu)活(huó)性(xìng)酶(méi)，熒光(guāng)探(tàn)針等試(shì)劑，需要低溫保(bǎo)存(cún)，以免(miǎn)其(qí)化(huà)學性質發(fā)生變化，因(yīn)此需(xū)要冷(lěng)凍幹燥。凍(dòng)幹(gān)熒光PCR試(shì)劑的(dí)主要方(fāng)法步驟(zhòu)包括：
1，液體(tǐ)準(zhǔn)備。熒(yíng)光PCR擴(kuò)增緩衝液，引物(wù)，探(tàn)針(zhēn)，酶和凍(dòng)幹保護劑按(àn)配方混合，凍幹保(bǎo)護劑的選(xuǎn)擇非常(cháng)重(zhòng)要。常(cháng)見的凍(dòng)幹保護劑包(bāo)括(kuò)糖類(lèi)，多元醇，聚合物，表麵活(huó)性(xìng)劑，氨(ān)基(jī)酸(suān)，鹽類等。一(yī)種(zhǒng)可凍(dòng)幹(gān)的保護劑通常含有(yǒu)一(yī)種(zhǒng)以(yǐ)上(shàng)的(dí)保(bǎo)護(hù)劑，但(dàn)也(yě)可以(yǐ)組合(hé)使(shǐ)用多(duō)種保(bǎo)護(hù)劑(jì)。然而(ér)，凍幹保護(hù)劑配方的(dí)探索是一(yī)個(gè)耗(hào)時(shí)的(dí)過程，也是(shì)凍(dòng)幹成功(gōng)的(dí)關鍵。
2，冷凍幹燥(zào)。準備好(hǎo)上述可凍幹(gān)反應(yīng)試劑，分(fēn)裝成PCR八(bā)管(guǎn)或定製(zhì)PCR管，然後放(fàng)入(rù)PCR分子凍幹機，開始整個(gè)凍(dòng)幹(gān)過程(chéng)。冷(lěng)凍幹燥過(guò)程(chéng)通常分為三個不同的階段：預(yù)冷凍階段(duàn)，初級幹燥(zào)階(jiē)段和(hé)次級幹(gān)燥(zào)階(jiē)段。在(zài)預凍(dòng)階段，溫度一(yī)般(bān)在-50～-40℃保(bǎo)持2-3H。預凍(dòng)後(hòu)，保(bǎo)持(chí)凍幹(gān)機(jī)內溫度(dù)不變，開始抽真(zhēn)空至(zhì)5-10pa，保持10-20h。升(shēng)華(huá)後，將凍幹(gān)機內部溫度(dù)升(shēng)至(zhì)-35~-25℃並在(zài)真空下保持(chí)1-2h，然後繼續(xù)將(jiāng)凍幹機內(nèi)部(bù)溫(wēn)度(dù)升至(zhì)-5~5℃並保(bǎo)持(chí)1-真(zhēn)空(kōng)下(xià)2h。最後，在真空(kōng)下(xià)繼續將(jiāng)凍(dòng)幹機(jī)內(nèi)部溫度(dù)升(shēng)至(zhì)25-35℃，保(bǎo)持10-12h。凍幹(gān)後(hòu)可通入氮(dàn)氣(qì)，然(rán)後按(àn)下塞(sāi)子即可完成整個(gè)凍幹操作。凍(dòng)幹法製(zhì)備(bèi)的熒光(guāng)PCR試劑可在室溫(wēn)避光保(bǎo)存(cún)。它性(xìng)質穩定(dìng)，易(yì)於運(yùn)輸和使用。使(shǐ)用(yòng)時隻(zhī)需加(jiā)入(rù)溶解(jiě)液或(huò)稀釋(shì)劑(jì)即可。
PCR分子凍(dòng)幹(gān)機采用不(bù)鏽鋼板(bǎn)設計(jì)，保(bǎo)證(zhèng)箱(xiāng)體(tǐ)表麵(miàn)光潔(jié)度(dù)，從而保(bǎo)證無(wú)菌要求。所(suǒ)設計的板層(céng)強度高(gāo)，可(kě)保(bǎo)證在(zài)長期使用(yòng)過(guò)程(chéng)中對壓(yā)蓋(gài)無滲漏(lòu)，變形和影(yǐng)響。板(bǎn)層通(tōng)過機(jī)械(xiè)加工可(kě)以(yǐ)保證(zhèng)對平整(zhěng)度(dù)要(yào)求高(gāo)，平整(zhěng)度好(hǎo)，凍幹箱板(bǎn)層溫(wēn)度均匀性(xìng)好。板(bǎn)層(céng)控(kòng)製溫度-55～70℃，控製(zhì)溫度範圍寬(kuān)，加熱和(hé)冷(lěng)卻溫(wēn)度可控(kòng)，效率(shuài)高。冷阱的(dí)極(jí)限(xiàn)溫(wēn)度(dù)≤-85℃，可(kě)對(duì)-50以(yǐ)上的任何共晶點進行凍(dòng)幹(gān)，適用範圍(wéi)廣(guǎng)，對低(dī)共晶點(diǎn)溫度的(dí)分(fēn)子(zǐ)試(shì)劑更安全(quán)。
